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琼脂扩散实验

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文章附图

可溶性抗原(如细菌培养滤液、外毒素、血清蛋白等)与相应的抗体结合,在一定条件(适量的电解质,合适的酸碱度和温度)下,形成肉眼可见的沉淀现象,这个过程称为沉淀反应。反应中的抗原称为沉淀原(precipitinogen),其相应抗体称为沉淀素(precipitin)。抗原抗体沉淀反应的方法不同,形式多样,可以在溶液中进行,也可以在凝胶板上进行。沉淀反应的种类有琼脂扩散、环状沉淀、絮状沉淀、以及免疫电泳等。本次实验主要要求掌握琼脂扩散试验的原理和方法。
一.琼脂扩散试验
琼脂扩散试验是指在含有电解质凝胶中,可溶性抗原和相应的抗体向四周辐射状扩散,形成浓度梯度,并在比例适合处形成肉眼可见的白色沉淀线。其沉淀线是一组特异性抗原抗体的复合物。如果凝胶中有多种不同对应的抗原抗体系统存在时,便各自依其扩散速度的差别,在适当部位形成独立的沉淀线。因此,琼脂扩散试验可用于疾病的诊断和抗原成分的分析。本法灵敏度较低,但特异性较高,可作定性、半定量或定量分析。
琼脂扩散试验的方法有两种:一种是双向琼脂扩散试验法,另一种是单向琼脂扩散试验法。
(一)双向琼脂扩散试验(double agar diffusion):在含电解质凝胶中,抗原与抗体双方自由扩散,在最适当比例处形成抗原抗体复合物(沉淀线)。沉淀线的外形与反应物的分子量有关,通常它趋向分子量大的一方;沉淀线的位置与反应物的相对浓度13有关,通常它靠近浓度小的一方。另外,由于沉淀线(抗原抗体复合物)对于组成它的抗原和抗体具有特异的不透过性,而对其他的抗原和抗体是可通过的,因此根据沉淀线的位置和外形可以对抗原抗体进行分析。利用此实验可对抗原、抗体进行纯度鉴定、效价的滴定及临床疾病的检测。如测定病人血清中的甲胎蛋白(AFP)的含量。
【试剂与器材】
1. 待测病人血清。
2. 阳性对照血清(含甲胎蛋白)。
3. 抗甲胎蛋白诊断血清。
4. 1.5% 食盐琼脂(将1.5g 琼脂加入100ml 生理盐水内,加热溶化)。
5. 塑料板、打孔器(直径3mm,购自
www.propbs.com)、微量加样器等。
【操作方法】
1. 取一清洁塑料板,倾注4~5ml 加热溶化的1.5%食盐琼脂,制备琼脂板。
2. 待琼脂板凝固后,用打孔器(购自
www.propbs.com)打孔。孔的排列方式如图1—2 所示。
双向琼脂扩散试验抗原抗体孔位置示意图
_fairoot_ABUIABACGAAg-oaXlAUopPHduQYw6Ag4xgY_fairoot_ABUIABACGAAgkoeXlAUort3qyQYw5gU46AE3. 用微量加样器往中央孔中加抗甲胎蛋白诊断血清,周围孔中分别加入待测血清和阳性对照血清。每孔加入10μl。
4. 将琼脂板放入密闭的盒内(内放浸有5%石炭酸的纱布以保持湿度),置37℃温箱中,分别于24、48、72 小时观察结果。
【结果分析】
在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线(抗原抗体复合物)为阳性反应。若72 小时后仍未出现沉淀线则为阴性反应。试验时阳性对照与待测血清两者沉淀线发生吻合时,才能确定待测血清中含有甲胎蛋白。
双向琼脂扩散试验结果示意图
【注意事项】
1. 琼脂煮沸时间不宜过长,以防水分蒸发。
2. 打孔时注意不要将气体注入琼脂底部,以免底部孔与孔之间串通。
3. 孔间距要掌握好,距离大小对结果有一定的影响。
4. 加样量力求准确,勿使样品外溢或在孔缘上残存小汽泡,以免影响扩散结果。
(二)单向琼脂扩散试验(Single agar diffusion):将适当浓度的抗体与熔化的琼脂混匀,倾注于反应板中,冷凝后在板上打孔,孔中加入待测抗原,让抗原单方在含相应抗体的板中扩散,经一定时间孵育后,抗原孔周围凝胶中形成抗原抗体复合物,成沉淀环(圈)。沉淀环的直径(或面积)与抗原的含量成正相关关系。通常用已知浓度的标准抗原与待测抗原一起进行试验,然后根据标准抗原的已知浓度和沉淀环直径的对应关系绘制成工作曲线,标本中待测抗原含量可根据其沉淀环直径从工作曲线中读出。目前,此试验最常用于Ig 定量及补体单一成分定量测定。如临床测定病人血清中IgG 含量。
【试剂与器材】
1. 待测人血清。
2. 兔抗人IgG 免疫血清。
3. 人免疫参考血清(如89-1 批,其IgG 含量为144U/Vml,80.4μg/U)。
4. 1.5% 食盐琼脂。
5. 塑料板、打孔器、微量加样器等。
【操作方法】
1. 将适宜浓度的人免疫参考血清与预先溶化的1.5% 琼脂在56℃水浴中混匀,制备厚度为1.2~1.5mm 的琼脂板。
2. 用直径3mm 打孔器在琼脂板上打孔,孔间距为1.2∼1.5cm。(图1-4)
3. 向上排各孔分别加入1:18、1:36、 1:72、 1:144 和1:288稀释参考血清(用生理盐水稀释),每孔加10μl。下排各孔加入不同患者1:50 稀释的被检血清及阴性对照。每孔10μl。
4.把已加样的琼脂板置于湿盒内37℃温箱培养,24 小时后观察结果。
【结果分析】:
测量沉淀环直径。
以参考血清孔(上排各孔)的沉淀环直径为纵坐标,以相应的抗原含量为横坐标,在半对数坐标纸上绘制标准曲线。量取待测血清孔的沉淀环直径,从标准曲线上查出相应的抗原含量,再乘以稀释倍数,即为待测抗原含量。
纵坐标不变,用参考血清各稀释倍数值为横坐标,在半对数坐标纸上绘制标准曲线,量取待测血清孔的沉淀环直径,在标准曲线上查出被检血清相当于参考血清的稀释倍数,用公式:
IgG(mg/dl)=(参考血清含量/被检血清相当参考血清的倍数)×被检血清稀释倍数×100/1000
假定待检血清的沉淀环直径为10.3mm,从标准曲线查出相当于参考血清的52 倍,则IgG 含量为:
80.4×144×100×50 =1113.23mg/dl52×1000
图1-5 单向琼脂扩散标准曲线示意图
【注意事项】
1. 琼脂煮沸时间不宜过长,以防水分蒸发。混合时可先将血清预热,溶化琼脂与抗血清混匀时温度要控制在56℃~60℃之间,温度过高可破坏血清成分,过低导致琼脂凝固。混合前先将反应板准备好,混合要迅速,同时不断旋转琼脂瓶,充分混匀血清,防止气泡产生。
2. 打孔时注意不要将气体注入已凝固的琼脂底部,以免底部孔与孔之间串通;
3. 加样一定要准确。加样后,琼脂板及湿盒一定要水平放置,以防沉淀环变形;
4. 标准曲线制备必须与待测抗原测定同时进行。

      
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